從原理上來講，3D光片顯微技術與傳統的寬場顯微技術或共聚焦顯微技術有很大不同，后兩者需要照射或掃描成像目標物中的整個樣本，而光片顯微鏡只需要用薄層光（實際上為2D）從側邊照射樣本。隨后從樣本的上部或下部檢測所產生的熒光信號，檢測方向與薄層光線的照射方向相垂直。因此，該技術的光學層析能力（optical sectioning，即層面上樣本結構的分辨能力）不像共聚焦成像技術那樣取決于焦點處光子的采集，而是來自于在開始時每次僅激發一個層面上的熒光基團。換言之，光片顯微技術只會激發一個焦平面上或旁邊的分子，因此降低了光毒性，并且提高了長時間對活體樣本進行成像的能力。基于3D光片熒光顯微鏡本身的技術特點，該系統滿足了快速、大體積3D成像、低光毒性及長時間成像的需要。